DNA kann man lesen: Mit der DNA-Sequenzierung

Das „Human Genome“ Projekt feiert sein 10-Jahresjubiläum. Im Jahre 2003 war das Ablesen der gesamten Sequenz der menschlichen DNA abgeschlossen. Das heisst, dass nun die gesamte genetische Information des Menschen in Form einer langen Buchstabenabfolge vorhanden ist. Das gleiche gilt für das Genom vieler anderer Organismen und weitere werden in Zukunft dazukommen.

Warum wollen wir die DNA-Sequenz kennen?

Hier einige Beispiele:

Diagnose von Erkrankungen
In der Medizin werden DNA-Sequenzen von Patienten mit erblich vererbbaren Erkrankungen mit DNA-Sequenzen von gesunden Menschen verglichen. Das Ziel ist, die veränderte (mutierte) DNA-Sequenzen im Patienten zu identifizieren. Diese Information kann dann verwendet werden, um bereits bei ungeborenen oder jungen Menschen diese DNA-Veränderung zu detektieren, damit das Risiko einer Erkrankung zu bestimmen, und wenn möglich früh mit einer Therapie zu beginnen. Wenn man weiss, wo die DNA Veränderung aufritt, kann man auch den Grund der Erkrankung besser verstehen. Dies erleichtert die gezielte Entwicklung von Medikamenten.

Bekämpfung von Resistenzen
Antibiotika werden gegen bakterielle Infektionen eingesetzt. Manche Bakterien überleben diese Behandlung, weil sie gegen ein oder sogar mehrere Antibiotika resistent werden. Ihre DNA akkumuliert Mutationen, die eine veränderte DNA-Sequenz zur Folge haben. Proteine, die anhand dieser neuen Sequenz gebildet werden, haben neue Funktionen und erlauben dem Bakterium den Antibiotikaangriff zu überleben. Mit Hilfe einer Sequenzierung der bakteriellen DNA kann geforscht werden, wie genau diese Resistenz zustande gekommen ist, und entsprechende Medikamente können entwickelt werden.

Bestimmung der stammesgeschichtlichen Verwandtschaft von Organismen
Die DNA-Sequenzierung wird auch in der Systematik (Forschungsgebiet, das sich mit der Benennung und der Stammesgeschichte der Lebewesen beschäftigt) verwendet. Damit können die Verwandtschaftsgrade zwischen verschiedenen Organismen untersucht und Informationen über ihre Evolution gewonnen werden.

Wie läuft eine Sequenzierung ab?

Es gibt viele Möglichkeiten eine DNA-Sequenzierung durchzuführen und die Methode entwickelt sich ständig weiter.

Voraussetzung für jede DNA-Sequenzierung ist genügend DNA. Diese bekommt man mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (englisch: Polymerase Chain Reaction, PCR). Bei der PCR wird die DNA-Doppelhelix aufgetrennt und die Einzelstränge bilden die Vorlage für neue DNA Doppelstränge. Die zugegebenen Primer (künstlich hergestellte kurze, einzelsträngige DNA-Stücke einer gewünschten Sequenz) lagern sich an die komplementären Einzelstränge der DNA an und das Enzym DNA-Polymerase baut mit synthetischen Nukleotiden Stück für Stück eine neue Doppelhelix nach der Vorlage des Einzelstrangs auf. Somit bekommt man eine Menge DNA, mit der man weiterarbeiten kann.

Die Kettenabbruch- Methode nach Frederick Sanger

Für die Sequenzierung wird ein spezieller Trick verwendet. Zusätzlich zu den vier normalen Nukleotiden werden vier spezielle Stopnukleotide in die PCR-Reaktion gegeben. Sie unterscheiden sich von den normalen Nukleotiden daran, dass sie nur an einer Seite mit einem anderen Nukleotid verknüpft werden können. Wird also von der Polymerase ein Stopnukleotid an Stelle eines normalen Nukleotids in die wachsende Nukleotidkette angefügt, bricht die DNA Synthese an dieser Stelle ab, da kein weiteres Nukleotid ans Stopnukleotid angeheftet werden kann. So entsteht eine Vielzahl von unterschiedlich langen DNA Stücken (Kettenabbruchprodukten), die immer mit einem Stopnukleotid enden.

Ein Laser liest den Farbcode

Jedes der vier Stopnukleotide ist mit einem unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoff gekoppelt. Nach der Sequenzierreaktion, die wie eine PCR in einem Thermocycler stattfindet, werden die Kettenabbruchprodukte in eine Kapillare gegeben und ein elektrisches Feld wird daran angelegt. Die DNA-Stücke laufen nun ihrer Grösse nach unterschiedlich schnell durch die Kapillare. An einer Stelle der Kapillare befindet sich ein Laser. Er regt das Farbmolekül an, das am DNA-Stück hängt, welches gerade durch die Kapillare läuft. Ein Detektor erkennt die entsprechende Farbe. Die Reihenfolge der Farben, in der sie erkannt werden, entspricht der Reihenfolge der Nukleotide im ursprünglichen DNA-Molekül und ergibt die DNA-Sequenz.

Diese Methode wird häufig im Alltag eines Forschungslabors eingesetzt.

Neue Technologien sind effizienter

Bei der Pyrosequenzierung wird die Sequenz nicht erst nach sondern während der Sequenzierreaktion abgelesen. Hier werden keine farbmarkierten Stopnukleotide, sondern normale, unmarkierte Nukleotide verwendet. Um herauszufinden, an welcher Stelle welches Nukleotid eingefügt wird, kommt folgender Trick zum Einsatz: Die vier verschiedenen Nukleotide werden nacheinander zu den DNA-Einzelsträngen gegeben. Sobald ein Nukleotid an einer komplementären Base des Einzelstrangs bindet, wird ein Blitz erzeugt. Dieser wird von einer hochleistungsfähigen Digitalkamera aufgezeichnet. Danach werden die überschüssigen Nukleotide entfernt. Nun beginnt ein neuer Zyklus, bei dem wieder die vier Nukleotide nacheinander zu den DNA-Einzelsträngen gegeben werden und ein Lichtblitz erfasst wird. So entsteht ein Film, der die Abfolge aller Lichtsignale aufweist. Da man weiss, welches Nukleotid wann hinzugegeben wurde, kann man an der Abfolge der Blitze auch die Basenabfolge nachvollziehen. Diese Methode wird eingesetzt, wenn ganz viele DNA-Proben analysiert werden sollen.

Die neuen Technologien machen die DNA-Sequenzierung sehr viel schneller. Während das „Human Genome“ Projekt, bei dem das menschliche Erbgut sequenziert wurde damals noch 13 Jahre gedauert hatte, könnte das gleiche Vorhaben mit den neuesten Technologien heute innerhalb eines Tages für einen Bruchteil der Kosten vollbracht werden.