Leggere il DNA, il sequenziamento del DNA

Se il genetista vuole leggere un gene deve, per prima cosa, copiarlo. All'inizio si procede come per la replicazione del DNA, il cui funzionamento ti è stato spiegato nel capitolo precedente.

• molte copie del gene da leggere.
• Primers, i corti frammenti di DNA a singolo filamento identici all'inizio  del gene d'interesse. In questo caso sono marcati radioattivamente con una determinata sostanza.
• Un duplicatore di DNA, la DNA polimerasi.
• Una grande quantità dei quattro componenti del DNA: A, T, G e C.

Il genetista ripartisce il tutto in quattro provette, etichettate come A, T, G e C. Aggiunge poi in ogni provetta un elemento che compone il DNA provvisto di uno "stopper": nella prima provetta A-STOP, nella seconda T-STOP, nella terza G-STOP e nella quarta C-STOP. Quando la DNA polimerasi aggiunge un componente-STOP, la replicazione viene bloccata e nessun ulteriore elemento può essere aggiunto.

Come durante un processo di replicazione normale (reazione a catena della polimerasi), le quattro provette sono poste in un apparecchio nel quale è possibile impostare la temperatura automaticamente.

• A 94°C i due filamenti di DNA si separano.
• A 60°C i primers corrispondenti si fissano sul DNA.
• A 72°C la DNA polimerasi aggiunge, uno dopo l'altro, gli elementi che compongono il DNA.

A differenza di un processo di replicazione normale, ad un certo punto un componente-STOP viene incorporato nella copia di DNA. Ogni volta che questo succede, la riproduzione si interrompe. Nella provetta A si troveranno quindi dei frammenti di DNA di lunghezza differente, ma che terminano tutti con una A-STOP. Lo stesso accade nelle altre provette.

I frammenti di DNA sono separati secondo la loro lunghezza tramite il metodo dell'elettroforesi su gel (capitolo: tagliare il DNA in pezzi). Il contenuto della provetta A è caricato sulla prima corsia del gel, gli altri sulle tre corsie seguenti.

Una volta che l'elettroforesi è terminata, il genetista può produrre una specie di film radiografico grazie ai primers marcati. Nella corsia della provetta A si trovano frammenti di DNA di lunghezza differente terminanti con la lettera A. Lo stesso vale per le altre tre corsie.

Il genetista può quindi leggere il gel, procedendo dal basso verso l'alto. Se il più piccolo frammento di DNA si trova nella corsia della provetta C, si annota una C. Nel caso in cui il secondo frammento di DNA più corto si trovasse nella corsia della provetta G, andrebbe annotata una G. Proseguendo in questo modo, il ricercatore potrà leggere tutte le lettere del gene d'interesse e definirne quindi la sequenza.