Par rapport aux autres méthodes, CRISPR/Cas9 se distingue par sa simplicité d'utilisation et une plus grande précision, ce qui a contribué à la généralisation de cette méthode considérée comme une révolution.
Composantes
L'idée de la méthode a été inspirée par un mécanisme de défense chez les bactéries. Elle utilise deux outils couplés : l'enzyme Cas9 et un brin d'ARN complémentaire d'une séquence d'ADN spécifique. Dans le jargon technique, on parle d'ARN guide (guide RNA, gRNA) ou d'ARN guide simple brin (single guide RNA, sgRNA). La tâche de Cas9 est de dérouler la double hélice d'ADN et de couper les brins d'ADN, tandis que l'ARN sert à trouver l'endroit de l'ADN que l'on souhaite modifier.
Déroulement
Quand CRISPR/Cas9 pénètre dans le noyau de la cellule, il se déplace le long de l'ADN jusqu'à ce qu'il trouve un motif PAM. Il s'agit d'une séquence de trois nucléotides (NGG, N pouvant être n'importe quel nucléotide) reconnue par Cas9, qui déclenche le déroulement de la double hélice. Si le gRNA ne correspond pas au tronçon d'ADN rendu accessible, le complexe se déplace plus loin. En revanche, si le gRNA et la portion d'ADN sont complémentaires, ils se lient l'un à l'autre, ce qui active la fonction de coupure de Cas9. L'enzyme coupe alors les deux brins d'ADN.
Il en résulte une cassure double brin, un grave dommage à l'ADN, que la cellule doit réparer immédiatement. Elle utilise à cet effet son propre système de réparation et réunit les extrémités des brins détachés. Comme cela se fait très rapidement, des erreurs se produisent parfois : une ou plusieurs bases peuvent être supprimées ou ajoutées par erreur. Cela provoque souvent un décalage du cadre de lecture, rendant impossible la synthèse d'une protéine fonctionnelle. Ceci inactive donc le gène. Mais il est également possible d'introduire dans la cellule un morceau d'ADN qui lui servira de modèle pendant la réparation, ce qui se traduit par l’insertion d’une séquence d’ADN étranger dans son propre ADN. (Pour plus d'informations sur la méthode lire « CRISPR/Cas, comment marche cette méthode de biologie moléculaire ? »)
Avantages de la méthode
Comparée aux autres techniques, la méthode CRISPR/Cas9 est considérée comme particulièrement bon marché, simple, efficace et précise. Un de ses grands avantages est qu'il suffit de varier le gRNA pour cibler différents gènes. Avec les autres techniques, il faut changer l'outil protéique correspondant, ce qui est beaucoup plus compliqué.
Applications et questions
CRISPR/Cas9 est maintenant utilisée largement tant en recherche fondamentale qu’en recherche appliquée. Cette méthode peut servir à étudier la fonction des protéines, elle peut faciliter la sélection de nouvelles variétés de plantes, aider à lutter contre les parasites ou être appliquée en thérapie génique humaine. (Pour plus d'informations sur les applications lire « CRISPR/Cas : une méthode, de nombreuses applications »). Il y a encore peu d'applications commercialisables ou autorisées, mais l'avenir semble appartenir à CRISPR/Cas9. C'est pourquoi les risques et les bénéfices de cette méthode font déjà l'objet de vifs débats tenant compte de considérations éthiques.
